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分子生物学试剂

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详细介绍Detailed Introduction

BioRun Fast Site-Mutation Kit
货号:MK003-S/M/L
规格:10/20/50 rxns 
价格:咨询有惊喜哟
 
 
一步法单/多位点定点突变试剂盒

产品描述
BioRun Fast site-mutation Kit是一款适用于基因快速定点突变的试剂盒套装,可以一步实现目标基因1-5个不连续位点的同时突变。本试剂盒是基于BioRun Seamless同源重组的单/多位点定点突变系统,包含BioPfu Super Mix、BioRun DpnI和Assemble重组试剂。BioRun Fast site-mutation Kit极大的简化了多位点突变的连续PCR过程,并且具有良好的稳定性和可重复性,能让你快速、便利的完成定点突变实验。

产品特点
◆ BioPfu Super Mix忠诚的复制目标基因和载体片段
◆ 基于同源重组原理,设计基因突变时不需要考虑酶切位点的影响
◆ BioRun DpnI 快速、高效的降解本底质粒,最大程度降低了野生型基因残留
◆ 1~5个不连续位点一次性突变,方便又迅速
◆ 试剂盒提供了定点突变需要的所有酶试剂,无需购买额外酶
◆ 适用范围:酶蛋白定点突变,酶蛋白结构域重组,DNA单/多碱基突变
◆ 定点突变引物设计工具:http://www.ftracker.net/tools/108.html

产品规格
 
储存与运输
低温运输,-20℃储存,有效期1年。

应用实例
示例一、T189M突变体构建
靶标蛋白ProI基因全长约2600 bp,重组在pET-30a载体上,将其189号氨基酸Thr突变为Met,主要实验过程如下:
1、使用2×BioPfu Super Mix扩增pET-30a_ProI重组载体(全长7.8Kb),PCR产物经0.5 μL BioRun DpnI消化10 min,2小时完成。
2、电泳检测PCR产物,条带单一且清晰明亮,取大约50ng PCR产物,加入2×BioRun Assemble Mix进行连接反应,50℃孵育15 min,30 min完成。
3、取5 μL连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,1.5小时完成(含无抗孵育1小时)。
4、过夜培养,次日挑取3个克隆子进行菌体PCR验证,全部为阳性克隆。
5、对克隆子1进行测序,结果如下:

 
示例二、KlenTaq突变体构建
RT-KTq2是Taq DNA聚合酶的一个突变体,包含L459M,S515R,I638F,M747K四个氨基酸突变,具有RNA逆转录活性和DNA聚合活性,wt型基因插入在pUC19上,突变体构建在pET-30a上,主要构建流程如下:
1、使用伯远在线引物设计工具设计pET-30a反向扩增引物对,RT-KTq2上下游引物对,L459M突变引物对,S515R突变引物对,I638F突变引物对和M747K突变引物对,10 min完成。
2、使用2×BioPfu Super Mix扩增pET-30a载体,使用RT-KTq2上游引物和L459M反向引物扩增突变片段1,L459M正向引物和S515R反向引物扩增突变片段2,……,M747K正向引物和RT-KTq2下游引物扩增突变片段5,2小时内完成。
3、电泳检测PCR产物,条带单一且清晰明亮,使用DNA连接反应用量计算工具计算载体和突变片段用量,加入2×BioRun Assemble Mix进行连接反应,50℃孵育15 min,整个过程在40 min内完成。
4、取10 μL连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,1.5小时完成(含无抗孵育1小时)。
5、过夜培养,次日挑取4个克隆子进行菌体PCR验证,全部为阳性克隆。
6、随机对克隆子2、4进行测序,突变体与野生酶比对结果如下:


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