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详细介绍Detailed Introduction

酵母双杂

酵母双杂交技术原理及应用:
Fields在1989年提出了酵母双杂交,打开了蛋白质相互作用筛选的快捷通道。这项技术的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个结构域,这俩个结构域虽然彼此相分开但在功能上是必需的。位于N端的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端转录激活域(Activation domain, AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence, UAS),并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录进行,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,转录启动子下游基因。
在酵母双杂交系统中,BD与X蛋白融合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,AD与BD会在空间上充分接近,重新构成结构域,启动特异基因序列的转录。拥有BD质粒的酵母菌可以在某一缺陷培养基上生长,拥有AD质粒的酵母菌可以在另一种缺陷培养基上生长。通过接合(mating)或共转化使酵母菌同时拥有AD与BD质粒,如果BD上的诱饵蛋白与AD上的目的蛋白存在相互作用,。AD与BD的结合会启动下游基因的转录,这样的酵母菌株可以在三缺及四缺的培养基上生长,并启动β-半乳糖苷酶的基因进行转录。
酵母双杂交原理图
 
基于酵母双杂交的特点,它主要应用在以下几个方面:
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能;
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用;
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响;
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图。
 
点对点酵母双杂交验证实验流程:
1、诱饵蛋白毒性及自激活检测
2、共转化:分别将诱饵/捕获(pGBKT7-Bait/pGADT7-prey)、阳性对照(pGBKT7-p53/pGADT7-T)、阴性对照(pGBKT7-Lam/pGADT7-T)分别共转到Y2H Gold感受态细胞中,涂布于DDO平板培养。
3、点板验证:分别从平板上挑单克隆稀释10倍,100倍,1000倍,然后点板到TDO/X/A和QDO/X/A固体培养基进行验证
4、实验数据与报告整理
 
酵母文库筛选实验流程:
1、诱饵载体与菌株构建
2、诱饵质粒进行毒性及自激活检测
3、pGBKT7-Bait/Y2H Gold与酵母文库mating
4、文库筛选与3-AT优化
5、酵母文库筛选及结果测序分析
6、筛选结果回转验证
7、实验数据与报告整理
 
项目周期
点对点酵母双杂交验证约30天
酵母文库筛选约180天
 
交付结果
详细完整的实验报告,清晰的实验图片,筛选阳性克隆的测序结果、质粒等
 
客户下单项目信息填写:
1、客户按照提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式进行预提交;
2、提交项目所需要的具体信息,包括:(1)BD与AD质粒与相关序列信息;(2)尽可能丰富的相关资料、文献。

实验信息:
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看地址。实验结题后,实验报告,检测结果可在线查看或打印,并永久保留。


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