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详细介绍Detailed Introduction

酵母文库
酵母文库构建原理
提到酵母文库不得不提到酵母双杂。酵母转录因子GAL4包含有两个彼此作用但是空间上分离的结构域。一个是DNA结合域(DNA binding domain简称BD),另一个则是转录激活域(Activation domain简称AD)。当两个结构域充分接近的时候则呈现完整的GAL4转录因子活性,并可以激活下游的报告基因。因此可以将想要研究的两个蛋白分别连在含有AD与BD的载体上,之后通过转染酵母,如果这两个蛋白相互作用,则会使AD和BD在空间上相遇,从而激活下游的报告基因,从而表示这两个蛋白是有相互作用的。但是这只能研究两个特定蛋白的相互作用,并且这种方法和大程度上依赖于网站的预测,以及实验人员的猜想。为了研究某种蛋白与哪些蛋白有相互作用,酵母文库就诞生了。
所谓的库,顾名思义就是仓库。也就是包含有所有基因的一个大仓库。我们通过提取想要研究物种的总RNA,之后分离出具有编码蛋白功能的mRNA,通过逆转录得到cDNA。之后我们将这些cDNA全部与AD载体连接。这样就得到了一个大的AD文库,之后将其转入酵母中,这样每一个酵母都含有一个构建好的质粒。理论上,这样的一个文库内的酵母能够表达该物种内所有的蛋白。
上面讲到的酵母文库的建立主要是以酵母双杂交为基础的,对于酵母单杂交文库的构建,其原理大致相同,这里就不再赘述。
 
文库构建策略比较:
    
实验流程
1、客户样品QC,total RNA提取(也可由客户直接提供total RNA)
2、利用磁珠分选进行mRNA分离
3、以mRNA为模板使用Clontech的SMART技术合成cDNA
4、使用磁珠分选进行cDNA分级分离高效去除小片段
5、将分级纯化的cDNA与pGADT7线性化载体进行同源重组
6、重组产物纯化后电转化DH10B感受态并涂布平板
7、cDNA文库质量验证
8、文库质粒提取
9、文库质粒转化酵母Y187(可选)
  
相关实验结果案例展示
1、 total RNA提取结果:
2、 cDNA磁珠纯化去除小片段
3、 大肠杆菌文库随机挑单克隆菌落PCR验证插入片段大小与阳性率
                 
项目周期
35个工作日
 
质量标准
1、原始文库容量大于10^7 CFU
2、平均插入片段大于1200 bp
3、克隆阳性率大于95%
 
酵母文库交付结果
1、大肠杆菌文库甘油菌 1 mL/管 * 50管
2、文库质粒500 μg
3、酵母文库 1 mL/管 * 50管(可选)
4、文库构建相关图片与测序结果
5、文库构建报告
 
材料要求
针对每个文库,客户需提供至少能提取500 μg总RNA的新鲜样本,或者至少500 μg的高质量总RNA。
 
客户下单
项目信息填写:

1.客户按照提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式进行预提交;
2.提交项目所需要的具体信息,包括:(1)已知的材料与组织信息;(2)尽可能丰富的相关资料、文献。 
3.材料:用于提取total RNA的组织材料或者已提取好的total RNA;

实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时90系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看地址。实验结题后,实验报告,检测结果可在线查看或打印,并永久保留。


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